Tests d’écotoxicité aquatique

Système biologique exposé

• Levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Activation ou inhibition du récepteur humain des œstrogènes (test YES, effets œstrogéniques ou anti œstrogéniques)
• Activation ou inhibition du récepteur humain des androgènes (test YAS, effets androgéniques ou anti androgéniques)

Principe (exposé dans le cas du test YES)

• Visualisation des effets œstrogéniques grâce au couplage du gène du récepteur humain des œstrogènes avec un gène rapporteur (LacZ) dans des cellules de levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) génétiquement modifiées.
• La fixation d’une substance à effet œstrogénique au récepteur des œstrogènes provoque la traduction/transcription du gène correspondant et donc du gène rapporteur qui lui est associé. Ce dernier code pour une enzyme, la β-galactosidase, qui catalyse une réaction colorimétrique (passage du jaune au rouge) pouvant donc être directement mise en relation avec la présence de substances à activité œstrogénique. heures
• Au bout de 18 heures d’exposition, l’induction de la réaction colorée permet de juger de l’œstrogénicité de la substance ou de l’échantillon étudié(e).
• Le même principe peut être utilisé pour mettre en évidence la présence de substances provoquant des effets anti œstrogéniques par le test YES ou des effets androgéniques ou anti androgéniques par le test YAS.

Diagramme

• Download diagramme YES
• Download diagramme L-YES

Vidéo tutorielle

Durée de l’essai

• 3 jours (durée d’exposition: 18 heures)

Intérêt

• Convient à la détection de nombreuses substances naturelles ou artificielles agissant sur le système hormonal comme certains perturbateurs endocriniens issus des produits de consommation courante comme la pilule contraceptive (17α-éthinylestradiol), les plastiques (bisphénol A, phtalates), les pesticides (méthoxychlore) ou les détergents (alkylphénols des surfactants non ioniques).
• Les substances interférant avec le système endocrinien en activant ou en inhibant les récepteurs des œstrogènes ou des androgènes peuvent par exemple perturber les fonctions reproductrices, affecter le métabolisme et le système immunitaire et provoquer le développement de tumeurs cancéreuses.

Normes et références

• Aucune norme internationale n’a encore été établie
• Routledge EJ and Sumpter JP (1996). Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15(3): 241-248.

Système biologique exposé

• Lignée de cellules humaines U2OS-ERα ou bien U2OS-AR

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Activation ou inhibition du récepteur humain α des œstrogènes (effets œstrogéniques)
• Activation ou inhibition du récepteur humain des androgènes (effets androgéniques)

Principe

• Ce test fait appel à une lignée cellulaire humaine dans laquelle le gène du récepteur des œstrogènes/androgènes a été couplé à un gène dit rapporteur codant pour la luciférase.
• La fixation de substances œstrogéniques/androgénique au récepteur des œstrogènes/androgènes provoque la traduction/transcription concomitante du gène correspondant et du gène rapporteur associé codant pour une enzyme, la luciférase, qui catalyse une réaction luminescente d’oxydation de la luciférine.
  L’émission de lumière est proportionnelle à la quantité de substance se liant au récepteur.
• Les mesures de luminescence sont effectuées au bout de 24 heures d’exposition aux substances ou échantillons à tester.
• Selon le même principe, les substances anti-œstrogénique sont detectés dans le test anti-ER-Calux® et les substances anti-androgènique dans le test AR-Calux®.

Durée

• 3 j (durée d’exposition: 24 h)

Intérêt

• Convient à la détection de nombreux toxiques issus de produits de consommation courante comme la pilule contraceptive (17α-éthinylestradiol), les plastiques (bisphénol A, phtalates), les pesticides (alachlor, méthoxychlore) ou les détergents (alkylphénols des surfactants non ioniques)
• Généralement plus sensible que les tests YES et YAS

Normes et références

• Pas de norme internationale disponible pour le moment
• Van Der Linden SC, Heringa MB, Man HY, Sonneveld E, Puijker LM, Brouwer A, Van Der Burg B (2008). Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents and surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42: 5814-5820.

Système biologique exposé

• Cellules tumorales corticosurrénales humaines

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Modifications des concentrations d’hormones stéroïdes (perturbation de la stéroïdogenèse)

Principe

• Test in vitro permettant de détecter les perturbations intervenant au niveau de la biosynthèse des hormones stéroïdes grâce à l’utilisation d’une lignée de cellules humaines capable d’exprimer la totalité des enzymes impliquées dans ce métabolisme. Cette lignée est d’autre part en mesure de synthétiser l’ensemble des hormones stéroïdes du système corticosurrénal fœtal et adulte.
• Les concentrations d’hormones (testostérone, œstradiol etc.) sont mesurées à l’aide de kits du commerce (type Elisa).

Durée

• 3 j minimum (durée d’exposition : 48 h)

Intérêt

• Détection in vitro des perturbations endocriniennes indépendamment de la fixation sur un récepteur.
• Permet d’estimer si les substances ou échantillons testés sont susceptibles d’influer sur la biosynthèse des hormones stéroïdes.
• „Outil“ d’étude des interactions entre substances chimiques et processus moléculaires et biochimiques de la voie de biosynthèse des stéroïdes

Normes et références

• Gracia T, Hilscherova K, Jones PD, Newsted JL, Zhang X, Hecker M, Higley EB, Sanderson JT, Yu RMK, Wu RSS, Giesy JP (2006). The H295R system for evaluation of endocrine-disrupting effects. Ecotoxicol. Environ. Saf. 65:293-305.
• Hecker M, Newsted JL, Murphy MB, Higley EB, Jones PD, Wu R, Giesy JP (2006). Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production. Toxicol. Appl. Pharmacol. 217:114-124.
• Hecker M, Giesy JP (2008). Novel trends in endocrine disruptor testing: The H295R Steroidogenesis Assay for identification of inducers and inhibitors of hormone production. Anal. Bioanal. Chem. 390:287-291.

Organisme de test

• Potamopyrgus antipodarum

Principe

• Potamopyrgus antipodarum est un petit gastéropode dulçaquicole vivipare originaire de Nouvelle-Zélande qui se reproduit de façon asexuée en Europe.
  Le succès de la reproduction est évalué à partir de la production d’embryons.
• La comparaison du nombre d’embryons chez les témoins et les gastéropodes exposés permet d’observer aussi bien les effets activateurs que répresseurs des substances ou échantillons testés sur la reproduction.

Paramètres et effets étudiés

• Production d’embryons (nombre d’embryons avec et sans coquille dans la poche d’incubation des adultes) (reprotoxicité)
• Mortalité des adultes géniteurs

Durée

• 28 ou 56 jours

Intérêt

• La reproduction est contrôlée par les hormones sexuelles et peut donc être influencée par les polluants perturbateurs endocriniens.
• Les substances globalement toxiques présentant une activité de type androgénique et anti-œstrogénique induisent une baisse de la production d’embryons.
• Les substances à activité de type œstrogénique induisent une augmentation spécifique de la production d’embryons.

Normes et références

• Pas de norme internationale disponible pour le moment
• Duft M, Tillmann M, Schulte-Oehlmann U, Markert B, Oehlmann J (2002). Entwicklung eines Sedimentbiotests mit der Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum (Gastropoda: Prosobranchia). Umweltwissenschaften und Schadstoff-Forschung 14: 12-17.

Organisme de test

• Algue verte unicellulaire d’eau douce (Raphidocelis subcapitata)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Inhibition da la photosynthèse (action herbicide)
• Inhibition de la croissance

Principe

• Les effets spécifiques sur la photosynthèse algale dus à une action herbicide sont mesurés au bout de 2 et 24 heures d’exposition à la substance ou à l’échantillon à tester tandis que l’inhibition, non spécifique, de croissance est évaluée en fin d’exposition.
• Le test combine une observation des effets sur la croissance avec une mesure de l’inhibition de la photosynthèse.
• Une inhibition de croissance révèle une toxicité non spécifique de l’échantillon et se mesure par la densité de cellules quantifiée par l’absorption à 685 nm.
• L’inhibition de la photosynthèse résulte d’une inhibition du photosystème II révélatrice de l’action toxique spécifique de substances aux propriétés herbicides.

Exécution du test

• Download diagramme test algues combiné
• SOP à commender gratuitement chez Andrea Schiffeli

Vidéo tutorielle

Durée

• 24 h

Intérêt

• Organisme représentatif des producteurs primaires
• Algue utilisée dans de nombreux tests standardisés d’évaluation de la qualité de l’eau (normes OCDE, ISO, US EPA)

Normes et références

• Escher BI, Bramaz N, Mueller JF, Quayle P, Rutishauser S (2008). Toxic equivalent concentrations (TEQs) for baseline toxicity and specific modes of action as a tool to improve evaluation of ecotoxicity tests on environmental samples J. Environ. Monit. 10, 612-621.
• Escher BI, Rutishauser S (2007). The combined algae test- a new routine 96-well-plate biotest for simultaneously assessing the photosynthesis inhibition and effect on growth in green algae. Internal Report, Eawag, Dübendorf, Switzerland
• International Organization for Standardization (2004). Water quality -- Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae. ISO 8692: 15 p.
• Schreiber U, Quayle P, Schmidt S, Escher BI, Mueller J (2007). Methodology and evaluation of a highly sensitive algae toxicity test based on multiwell chlorophyll fluorescence imaging. Biosens. Bioelectron. 22, 2554-2563.

Système biologique exposé

• L’enzyme acétylcholine estérase (d’anguille par exemple)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Inhibition de l’enzyme acétylcholine estérase (effets neurotoxiques dus aux organophosphorés ou aux carbamates = insecticides)

Principe

• L’inhibition de l’acétylcholine estérase par un toxique induit l’accumulation d’acétylcholine dans l’organisme, un neurotransmetteur dont la non-élimination induit une stimulation continue et dommageable des muscles et cellules nerveuses.
• La présence ou l’absence d’inhibition de l’enzyme est observée après exposition à la substance ou à l’échantillon à étudier.
• L’inhibition peut être mesurée aussi bien dans l’organisme entier que sur des enzymes isolées.

Durée

• 1 jour (durée d’exposition: 10 min)

Intérêt

• Se prête par exemple à la détection de pesticides fonctionnant spécifiquement par inhibition de l’acétylcholine estérase (organophosphorés, carbamates).

Normes et références

• Norme DIN : Deutsches Institut für Normung (1995). Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung - Suborganismische Testverfahren (Gruppe T) - Teil 1 : Bestimmung von Cholinesterase-hemmenden Organophosphat und Carbamat-Pestiziden (Cholinesterase-Hemmtest) (T 1). DIN 38415-1.
• Ellman GL, Courtney KD, Andres jr V, Featherstone RM (1961). A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7: 88-90.
• Hamers T, Molin KRJ, Koeman JH, Murk AJ (2000). A small-volume bioassay for quantification of the esterase inhibiting potency of mixtures of organophosphate and carbamate insecticides in rainwater: Development and optimization. Toxicol. Sci. 58:60-67.

Système biologique exposé

• Bactérie luminescente marine (Vibrio fischeri)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Inhibition de la bioluminescence (toxicité non spécifique)

Principe

• Le test est basé sur l’inhibition de la luciférase, une enzyme qui catalyse l’oxydation de la luciférine qui s’accompagne d’une émission de lumière. Un résultat positif indique la présence de substances agissant sur le métabolisme énergétique des cellules.
• Les effets des substances ou échantillons testés sur la bioluminescence bactérienne sont mesurés au bout de 30 minutes d’exposition.

Diagramme

• Download diagramme test de bioluminiscence bactérienne

Durée

• Environ une demi-journée (durée d’exposition: 30 min)

Intérêt

• Bon screening pour évaluer la toxicité d’échantillons de composition inconnue
• Bactérie utilisée dans de nombreux tests standardisés d’évaluation de la qualité de l’eau (normes OCDE, ISO, US EPA)
• Test fréquemment utilisé pour l’étude des eaux usées et effluents d’épuration, imposé dans certains pays (ordonnance allemande sur les rejets d’eaux usées par exemple)

Normes et références

• Norme ISO: International Organization for Standardization (2007). Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 3: Method using freeze-dried bacteria. EN ISO 11348-3.
• Escher BI, Bramaz N, Mueller JF, Quayle P, Rutishauser S, Vermeirssen ELM (2008). Toxic equivalent concentrations (TEQs) for baseline toxicity and specific modes of action as a tool to improve interpretation of ecotoxicity testing of environmental samples. J. Environ. Monit. 10, 612-621

Organisme exposé

• Gammarus fossarum

Effets détectables

• Réduction ou stimulation de la prise de nourriture chez les gammares

Principe

• Des gammares sont placés isolément dans des cages maintenues dans le cours d’eau en amont et en aval d’une source ponctuelle de pollution. Des feuilles pré-conditionnées sont mises à leur disposition pour leur alimentation.
• Les cages sont retirées au bout d’une semaine et les gammares et feuilles restantes séchés.
• Le taux d’alimentation est ensuite déterminé à partir du poids sec des microcrustacés et des feuilles avant et après exposition.

Durée du test

• Au moins 7 jours

Intérêt

• Les gammaridés sont des organismes détritivores qui se nourrissent de matière organique grossière et, dans une moindre mesure, d’algues et autres petits animaux (MacNeil et al. 1997). Ils jouent un rôle déterminant pour la dégradation des litières dans les cours d’eau et contribuent fortement à l’alimentation des poissons (Andersen et al. 1993).
• La baisse de prise de nourriture est une réaction non spécifique au stress qui, chez Gammarus fossarum, peut être causée par de nombreux facteurs (Maltby et al. 2002).
• La baisse du taux d’alimentation peut affecter le développement, la croissance et la reproduction (Naylor et al. 1989). Elle peut se répercuter sur les performances de la communauté et le fonctionnement de l’écosystème (dégradation des matières détritiques et litières).
• Le comportement alimentaire des gammares peut être influencé par des facteurs intrinsèques et extrinsèques: maladies parasitaires, origine de la population, taille des individus etc. (intrinsèques) ; température, oxygène dissous, pH etc. (extrinsèques).
• Pour pouvoir évaluer l’impact des rejets de stations d’épuration, ces paramètres doivent être connus avec précision. En général, la similitude des conditions physico-chimiques en amont et en aval des points de rejet permet assez facilement d’établir des comparaisons.
• Dans plusieurs études, une réduction du taux d’alimentation des gammares a été observée en aval des stations d’épuration (Bundschuh et al. 2011).

Organisme de test

• Grande daphnie (Daphnia magna)

Principe

• Mesure des effets des substances ou échantillons à tester sur la mobilité des daphnies après 24 ou 48 h d’exposition.

Paramètre étudié

• Inhibition de la mobilité (= mortalité)

Durée

• 24 ou 48 h

Intérêt

• Organismes zooplanctoniques des eaux stagnantes se nourrissant d’algues, les daphnies constituent l’élément de base de l’alimentation des poissons.
• Modèle biologique standard pour l’étude de l’écotoxicité aiguë des substances chimiques et échantillons d’eau

Normes et références

• OCDE (2004). Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimiques 202: Daphnia sp., Essai d’immobilisation immédiate.

Organisme de test

• Ceriodaphnia dubia
• Grande daphnie (Daphnia magna)

Principe

• Les polluants peuvent affecter la capacité des daphnies à assurer leur descendance.
• Les effets des contaminants chimiques sur la reproduction des daphnies sont étudiés dans un test de toxicité chronique réalisé sur 7/8 ou 21 jours.
• Dans ce test, des daphnies adultes sont maintenues dans un milieu expérimentalement contaminé ou un échantillon environnemental pendant une durée déterminée au bout de laquelle leurs descendants sont dénombrés.
• La comparaison du nombre de descendants de daphnies témoins et de daphnies exposées permet d’observer aussi bien les accroissements que les baisses du taux de reproduction.

Paramètres et effets étudiés

• Effets sur la croissance de la population/ le nombre de descendants (reprotoxicité)
• Mortalité des adultes géniteurs

Durée

• 7 ou 8 jours (C. dubia)
• 21 jours (D. magna)

Intérêt

• Organismes zooplanctoniques des eaux stagnantes se nourrissant d’algues, les daphnies constituent l’élément de base de l’alimentation des poissons
• Modèle biologique standard pour l’étude de l’écotoxicité chronique des substances chimiques et échantillons d’eau

Normes et références

• Norme ISO: International Organization for Standardization (2005) Water quality -- Determination of chronic toxicity to Ceriodaphnia dubia. ISO 20665. 21 p.
• Norme AFNOR: Association Française de Normalisation (2000). AFNOR NF T 90-376, Water quality—determination of chronic toxicity to Ceriodaphnia dubia in 7 days. Population growth inhibition test.
• Norme OCDE: OCDE (2004). Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimiques 211: Daphnia magna, essai de reproduction.

Système biologique exposé

• Cellules de mammifères: cellules de tissu conjonctif (fibroblastes) de souris

Principe

• L’impact des polluants sur la vitalité des cellules - et donc leur cytotoxicité - est évalué par la mesure de paramètres spécifiques après exposition d’une culture cellulaire aux substances à tester.
• Effets détectés (paramètres mesurés):
  - Intégrité membranaire (lactate déshydrogénase extracellulaire, LDHe)
  - Respiration cellulaire (sel de tétrazolium, XTT)
  - Teneur en protéines (coloration à la sulforhodamine, SRB)
  - Intégrité lysosomale (rouge neutre, NR)

Durée

• 3 j (durée d’exposition: 48 h)

Intérêt

• Permet la mise en évidence de substances susceptibles de compromettre les principales fonctions cellulaires des sujets exposés et donc potentiellement nocives pour leur organisme en général.

• olium Salz, XTT)
• Proteingehalt (Sulforhodamin-Färbung, SRB)
• Lysosomenintegrität (Neutral Red, NR)

Système biologique exposé

• Salmonelles (Salmonella typhimurium)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Altérations héréditaires du patrimoine génétique (effets mutagènes)

Durée

• 3 j (durée d’exposition: 48 h)

Principe

• Le test fait appel à un mutant de Salmonella typhimurium (mutant His) devenu incapable de synthétiser l’histidine et donc inapte à se développer sur milieu de culture privé de cet acide aminé.
• Au contact de substances mutagènes, les bactéries mutantes peuvent subir des mutations réverses qui leur restituent leur capacité à synthétiser l’histidine.
  Ces mutants réverses sont à nouveau capables de se développer sur milieu sans histidine.
• Plus le taux de colonies de mutants réverses est important parmi les bactéries exposées, plus le potentiel mutagène des substances testées est élevé.

Intérêt

• Permet la détection rapide d’un potentiel mutagène chez les substances ou mélanges testés (rapidité de multiplication des bactéries donc rapidité d’obtention de mutations)
• Facilité de détection des quelques mutants parmi la multitude de cellules restées intactes.

Mais:

• Méthode in vitro: Le comportement des substances dans les organismes complexes comme ceux des mammifères ne peut être simulé avec exactitude (simulation partiellement possible par apport de S9 Mix, un extrait de foie renfermant des enzymes du métabolisme à imiter)
• Un effet mutagène sur les bactéries n’implique pas nécessairement d’effet mutagène sur les mammifères
• Différence de complexité entre les bactéries et les cellules de mammifères (ces dernières disposent de systèmes capables de détecter les anomalies dans l’ADN et de détruire ou d’empêcher la multiplication des cellules touchées ; les bactéries sont des organismes unicellulaires)

Normes et références

• Norme DIN: Deutsches Institut für Normung (1999). Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung - Suborganismische Testverfahren (Gruppe T) - Teil 4: Bestimmung des erbgutverändernden Potentials mit dem Salmonella-Mikrosomen-Test (Ames Test) (T 4). DIN 38415-4.
• Norme ISO: International Organization for Standardization (2005). Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome test (Ames test). ISO 16240, 20 p.

Système biologique exposé

• Salmonelles (Salmonella typhimurium)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Activation du système SOS de réparation de l’ADN dans les cellules (génotoxicité)

Principe

• L’UmuC-test fait appel à une souche génétiquement modifiée de la bactérie Salmonella typhimurium.
• Les substances génotoxiques provoquent dans les cellules bactériennes l’induction du gène de la protéine UmuC qui intervient dans le mécanisme de réparation SOS mis en place pour préserver l’intégrité de l’ADN. Dans la souche bactérienne utilisée, ce gène a été couplé à un gène rapporteur codant pour la β-galactosidase, une enzyme qui catalyse la transformation d’un composé coloré et produit donc une réaction colorimétrique utilisable pour détecter la présence de substances génotoxiques.

Durée

• 1,5 j (durée d’exposition: 2 h)

Intérêt

• Mise en évidence de dommages causés à l’ADN (génotoxicité)
• La génotoxicité se définit par la capacité de certaines substances, dites génotoxiques, à induire des dommages dans l’appareil génétique ou génome. Au niveau cellulaire, ces substances génotoxiques peuvent provoquer des cassures chromosomiques, des insertions ou pertes de bases et donc des anomalies de lecture de l’ADN. Dans la plupart des cas, ces lésions sont détectées et réparées par le système SOS de la cellule. La présence de ces dommages à l’ADN peut alors être détectée par l’UmuC-test.
• Lorsque les altérations de l’ADN ne peuvent pas être réparées, elles sont transmises aux cellules-filles et à leur descendance. Ces effets, conséquence héréditaire et irréparable de la génotoxicité, sont qualifiés de « mutagènes ». C’est le test d’Ames qui permet de les mettre en évidence.

Normes et références

• Norme ISO: International Standard Organisation (1996/2000) Water quality - Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test, EN ISO 13829 (2000) and 38415-3 (1996).
• Escher BI, Bramaz N, Quayle P, Rutishauser S (2008). Monitoring of the ecotoxicological hazard potential by polar organic micropollutants in sewage treatment plants and surface waters using a mode-of-action based test battery, J. Environ. Monit. 10, 622-631.